Molekulyar genetik tadqiqot usuli

o'rganish va DNK tuzilishi ishlatiladi molekulyar genetik usuli variantlarni aniqlash uchun. xromosoma, gen yoki alal bu mintaqada ko'rib har bir DNK viloyati, uchun, usullari farq qiladi. Har bir molekulyar genetik usul asosiy ayrim yoki RNK va DNK boshqa erkalash o'z ichiga oladi. laboratoriya sharoiti amalga oshirilishi mumkin emas holda barcha Bu usullar, katta murakkabligi bilan ajralib turadi va xodimlar yuqori malakali bo'lishi kerak. Bu ish bir necha bosqichda amalga oshiriladi.

bosqichlari

Birinchi, RNK yoki DNK namunalari ishlab chiqarilgan bo'lishi kerak. Bu erda, bir molekulyar genetik usul deyarli har qanday material uchun qo'llanilishi mumkin: qonda, leykotsitlar bir tomchi, madaniyati fibroblastlarda, shilliq (shilinib), hatto soch follikullar, - DNK biron namuna olinishi mumkin. Bu har qanday molekulyar genetik usullari va ularning turli xil imkoniyatlari foydalanish mos va uzoq yakkalanib DNK muzlatilgan saqlanadi qilgan. u (tirik organizmni jalb holda, in vitro), in vitro polimeraz zanjir reaktsiyasini ta'minlash yordam beradi, deb, ikkinchi bosqichi, DNK kerakli parchalar (ko'paytirish) jamlash bag'ishlangan. Natijada, bu zanjir reaktsiyasi tomonidan tanlangan DNK qism ko'paytiradi va DNK ortadi marta tom ma'noda millionlab miqdori.

molekulyar genetik tadqiqotlar usullaridan uchinchi bosqich ko'paytirib DNK cheklash (bu parokandalik yirtib yoki chiqib ketish) qabul qilinadi. Cheklash bir poliakrilamid yoki agaroz jeli ustida elektroforez tomonidan amalga. DNK parchani o'rganish, bu molekulyar-genetik usul har bir gel ma'lum bir pozitsiya olish imkonini beradi. Shundan so'ng, gel etidiyum bromid bilan muomala qilinadi, DNK ulanish imkoniyatiga ega, ultrabinafsha nur bilan nurlantirish, u lüminesans qismlarini kuzatish mumkin. Molekulyar genetik diagnostika usullari, turli xil va ko'plab bor, lekin birinchi ikki qadam, barcha uchun umumiy bo'lgan. Lekin DNK qismlari aniqlash maqsadida, gel boshqa mavjud usullarini rangli va ko'p bo'lishi mumkin.

turlari

aniqlash mikobakteriyalar uchun eng to'g'ri va keng tarqalgan usullari yuqorida molekulyar genetik DNK ta'lim usuli o'z ichiga olishi mumkin. Uning mohiyati, deb patogen mikroorganizmlarga DNK maxsus parchalar scan zanjiri moddiy aniqlash maqsadida. Molekulyar genetik diagnostika texnikasi hali sil kabi kasalliklar tan yanada samarali yo'l yo'q. polimeraz zanjir reaktsiyasi (PCR) dan foydalanib, siz asl DNK, ya'ni, bir million marta replikatsiya sonini oshirish bo'ladi ko'paytirish mavjud bo'ladi, va u natijalarini namoyon bo'ladi, deb ishonch hosil bo'lishi mumkin. Bu usulning asosiy afzalligi hisoblanadi to'qson besh foizi, ko'proq - sezuvchanlik darajasi juda yuqori.

Bu holda tuzish namunasi, muayyan Oligonükleotit natija bir yuz olti marta ko'paydi ko'rsatadi, chunki hosil ko'p nusxada samaradorligini tadqiq molekulyar-genetik usullari qolgan tom ma'noda, ikki barobar. nafas olish tizimi sil hatto madaniyat tashxis sezilarli darajada xuruj pasaytir. Zamonaviy tibbiyot sil kasaliga molekulyar genetik usullari asoslangan nega bu. A tasvirlangan usul, yuqori antijenik o'zgaruvchanlik patogen mikroorganizmlarga bilan shug'ullanadigan boshqa yo'l aniqlash, ayniqsa ancha qiyin samarali - maxsus talab oziqlantiruvchi muhitlar va uzoq vaqt rivojlantiraylik. Biokimyoviy va molekulyar genetik usullari yakunlari bo'yicha juda boshqacha ta'sir ishlab chiqarish.

sil kasaliga

sil Marshall PCR et eng keng tarqalgan kasallik barcha to'rt turdagi uchun xos bo'lgan DNK-ketliklar foydalanib. Bu elementlar juda migratsiya turlari Mycobacterium tuberculosis va har doim genomunun mavjud bir nechta nusxasini tavsiflovchi sifatida bu maqsadga erishish uchun, tez-tez, natija elementlar (IS-986, IS-6110) IS aniqlash primerler foydalaning. Bundan tashqari DNK qazib olish har qanday boshqa tegishli usuli bilan sof madaniyat va Klinik (bemorlarning balg'am) dan amalga oshirilishi mumkin. Misol uchun, parchalanishiga bufer tashuvchisi DNK sifatida guanidine Tiyosiyanat va söz asoslangan bor Boom usuli ishlatiladi qaerda. har yili ortib kambag'al bakteriologik farq, va shuning uchun klinik amaliyotda tashkil etish mutlaqo boshqa darajaga o'rnatgan bemorlar soni: DNKni o'rganish molekulyar-genetik et usuli katta rol o'ynab kelmoqda.

Biroq, biz u nuqsonlarga holda emas, deb e'tirof kerak. PCR usuli ko'pincha foydalanish yolg'on-ijobiy natijalarning katta sonini olib keladi, va sababi nafaqat texnik xatolar, balki usuli o'zi xususiyatlari hisoblanadi. Bundan tashqari, belgilab berilgan mikobakteriyalar, yashovchanligi aniqlash uchun diagnostika, bu usuli yordamida, u oddiygina mumkin emas. Lekin, bu qobiliyatlar eng muhim emas. PCR diagnostika Molekulyar genetik usullari mikobakteriyel DNK ifloslanish xavfini sabab. Shuning uchun sertifikatlashtirish talablariga PCR laboratoriyalari uchun faqat qattiq mo'ljallangan, deb, ular uchta alohida binolar talab qiladi. PCR texnologiyasi tegishli asbob-uskunalar va yuqori malakali xodimlar foydalanishni talab, zamonaviy va juda murakkab.

bacterioscopy

tahlil tashxis natijalari boshqa ma'lumotlar bilan solishtirganda kerak bo'lsa: klinik ko'rikdan, rentgenografiya, tuhmat mikroskop, hosili va ma'lum bir davolash uchun ham javob juda muhim ahamiyatga ega. Ushbu ketma-ket, PCR tadqiqotlar faqat qismlariga biri hisoblanadi. bakteriologik - oddiy va tez usullari bo'lishi mumkin erta tashxisini patojenin aniqlash.

nur (Ziehl-Neelsen rang) mikroskop va Flüoresan (binoni fluorochromes) bor ishlatiladi. afzalligi natijalari tuhmat tezligi hisoblanadi. Lekin uning kamchiligi to'g'ri tufayli past sezgirlik cheklangan imkoniyatlar hisoblanadi. Biroq, bu usul eng iqtisodiy va sil bemorlarni aniqlash uchun asos JSST tavsiyalar beriladi. mikobakteri bakteriologik usul aniqlash bashorat qiymatini va taxmin miqdor bakterial chiqarilishini ega. Juda ham ishonch sil u molekulyar genetik tadqiqotlar usullari bilan shug'ullanish.

madaniyatlar

mikobakteriyalar yaxshi ixtiro madaniy tadqiqotlar tan. Bu tuxum o'rta qilingan patologik moddiy ekish: Mordovsky, Finn II LJ, va shunga o'xshash. va in vitro dori-darmon va mikobakteriyalar bir qator samaradorligini bilvosita dalillar va ularning koloniyalari uchun mikobakteriyalar qarshilik mezonlari, tadqiqot madaniyati qo'llaniladigan usuli bo'lsa. bir necha muhitlar o'tkaziladi patologik materiallar mikobakteri Kuluçkadan ajratish foizini oshirish uchun.

ko'p madaniy, patogen jumladan granti va suyuqliklar ehtiyojlarini qondirish. Bu tizimda ishlatiladigan va avtomatlashtirilgan o'lchash turi VANTES o'sish. Ekinlar etti sakkiz hafta qadar inkubatsiya o'tkazilgan bo'lishi kerak. Bu vaqtga kelib o'sish yo'qligi bilan hosil salbiy qabul qilinishi mumkin. Sil juda sezgir bo'ladi diagnostika moddiy zararlasa Gvineya to'ng'izlarni: Mycobacterium sil aniqlash uchun eng samarali yo'li biologik namunalarni ko'rib.

Ba'zi raqamlar

yashirin infektsiya - PCR tashxis ochdi o'rganish qiziqarli joy, M. sil o'rganish edi. Sil infektsiya zamonaviy tushunchasi M. sil bilan aloqada bo'lgan bir yuz kishidan, to'qson mumkin shuningdek bulg'angan bo'lishi, lekin ulardan faqat o'n faol kasallik ishlab chiqilmoqda, deb ko'rsatadi. Boshqalar TB immunitetni bor, va hollarda to'qson foizi, chunki infektsiya maxfiy qoladi. bir naqsh aniqlash, u bir molekula genetik usul yordam berdi.

Genetiklar kimning ekinlar patologik moddiy salbiy edi, va M. sil bilan kasallangan odamlar sakson foizi, lekin hech qanday kasallik rentgenologik namoyon oqib yotgan o'sha ellik besh foiz, PCR ijobiy javob oldi, deb aytish. Bu salbiy ularning tahlil (mikroskop va madaniyat) natijalari bilan, PCR tadqiqotlar tomonidan xavf ostida bemorlarni aniqlash yordam genetik diagnostika usuli edi, va subklinik infektsiya M. tuberculosis mavjud edi.

zamonaviy ilmiy-tadqiqot

Griess reagent sinovidan mikobakteriyalar bo'lgan nitrat redüktaz faoliyati: Russian Federation va bakteriologik laboratoriya mutlaq konsentrasiyalarda jadal usuli foydalaning. Anti-TB markazlari dori qarshilik aniqlash imkonini beradi usuli foydalaning. mikobakteriyalar radiometrik va lyuminestsent Buxgalteriya tizimi o'sishini avtomatlashtirilgan suyuq ommaviy axborot vositalarida bu ko'chat. Bunday tahlil tez amalga oshiriladi - ikki hafta.

Ayni paytda, yangi usullari ishlab chiqilmoqda: mikobakteriyalar dori qarshilik genotipi darajasida o'lchanadi. qarshilik genlar molekulyar mexanizmlari va o'rganish mikobakteriyalar ham borligini ko'rsatadi. Bu genlar ba'zi dori qarshilik bilan bog'liq. Masalan, Koson genlar, Inxa uchun, katG izoniazide, rpoB gen chidamli - rifampisin 16Sp RNK genlar va rpsL - streptomitsin, emb1 - olgan davolash, gyrA uchun - hokazo bir florokinolon va.

mutatsiyalar

zamonaviy tashxis sezilarli DNKni o'rganish uchun molekulyar-genetik darajasi usuli oshdi va barcha spektrida Mutatsiyalar keng ko'lamda tadqiqotlar amalga oshirish imkonini berdi. Endi biz eng keng tarqalgan 516, 526 va 531 kodonlarında Mutatsiyalar rpoB gen va turli dori qarshilik aniqlandi, deb bilaman. U erda nafaqat an'anaviy usullari yordamida mikobakteriyalar bir terilishiga usullari bir qator bo'lib - biokimyoviy biologik va madaniy, balki keng, zamonaviy molekulyar genetik metodlarni. Allaqachon bor etarli va monogenik kasalliklarni aniqlash uchun to'g'ri tashxis usuli bilan ta'minlash. Ular, ayniqsa, geni aniq sohasida DNK tadqiqotlar asoslangan. Bu, odatda, bir murakkab jarayon vaqt talab va qimmat, lekin molekulyar genetik tahlil tomonidan taqdim etilgan ma'lumotlar, ancha aniq va informatsion boshqa barcha tahlil ma'lumotlariga ko'ra bo'ladi.

Bu uzoq DNK har qanday yadroli hujayralar odnakova ekanligini organizmning butun hayoti davomida o'zgarmaydi, deb ma'lum, va bu iloji ontogenez har qanday bosqichida, tana juda barcha hujayralari tahlil olish uchun qiladi etildi. shikastlangan gen to'liq miqyosli klinik kasallik birinchi belgilari paydo, shuningdek, sog'lom heterozigot xalq oldida aniqlangan, lekin baribir Mutatsiyalar ega bo'lishi mumkin. Molekulyar genetik irsiy kasallik diagnostik usullari, uning (to'g'ridan-to'g'ri yondashuv, DNK-diagnostika) oshkor qilish, shuningdek, yaqindan bir zarar gen (ya'ni, DNK-diagnostika bilvosita yondashuv) bilan bog'liq marker lokuslar DNK (genetik polimorfizm) bilan oila kasallikning ajratishni tahlil qilish imkonini beradi. To'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita - har qanday DNK diagnostika inson DNK bir qat'iy belgilangan qismini aniqlash usullari asoslangan.

to'g'ridan-to'g'ri usullari

DNK tashxis bevosita usullari jinoyatchi gen irsiy kasallik, shuningdek ma'lum, ma'lum bo'lsa, va uning Mutatsiyalar turlari. Misol uchun, bir qator kasalliklar bir mos to'g'ridan-to'g'ri usullari. Bu Huntington shaytonlash (kengaytirish CTG-qaytarar), fenilketonüri (R408W), Mukovistsidozni fibroz (delF508, yirik mutatsiyalar) va shunga o'xshash. to'g'ridan-to'g'ri usuli asosiy afzalligi bir to'liq qarashli diagnostik aniqligi va oilaning qolgan bir DNK tahlil qilish hojat yo'q. tegishli geninde mutatsion topilgan bo'lsa, u aniq bir gunohkor oila dam olish uchun irsiyat, genotip aniqlash kasaliga tasdiqlash imkonini beradi.

to'g'ridan-to'g'ri tashxis yana bir afzalligi kasallikdan vafot etgan yaqinlari va ota-onalar yomon Mutatsiyalar bir heterozigot operatoringiz bilan aniqlash hisoblanadi. kasalliklar retsessiv otozomal uchun bu ayniqsa, to'g'ridir. to'g'ridan-to'g'ri usullari Kamchiliklari ham mavjud. Ularni amalga oshirish uchun, aniq bilaman, uning spektri va uning Mutatsiyalar anormal gen, ekson-Intro tuzilishini mahalliylashtirish kerak. Barcha monogenik kasalliklari bugungi kunda bunday ma'lumotlarni qabul qilmagan. bitta va bir xil gen irsiy kasalliklarning rivojlanishiga sabab patologik mutatsiya, bir qator bo'lishi mumkin, chunki Informativeness to'g'ridan-to'g'ri usullari, to'liq hisobga olinishi mumkin emas.

bilvosita usullari

DNK tashxis bilvosita usullar zarar gen belgilab bo'lsa, boshqa hollarda, barcha ishlatiladigan, lekin faqat xromosomalari, yoki yo'l tashxis (gen murakkab molekulyar tashkilot yoki katta daraja, bir joyi bor, agar bo'lsa, sodir bo'ladi natija bermagan bo'lsa patologik mutatsiyalar). Bilvosita usullar alal oilada polimorf ma'lumoti ajratish tahlil. Shu xromosomalari mintaqa yoki mavzu topilgan Marker yaqindan kasallik bilan bog'liq va o'chirishlar, qo'shimchalar, nuqta o'zgartirish, Takroriy vakili, va ularning polimorfizm blokda joylashtirish hujayralari turli miqdorda tufayli bo'ladi.

keng inson genomu taqsimlanadi bilvosita tashxis ko'rib mikrosatellit va minisatellite polimorfizm uchun eng qulay. marker va gen orasidagi genetik masofa zarar juda katta bo'lmasa, ularning qiymati, yuqori axborot mazmuni ifodalangan. ikkinchi holda, baholash aniqligi katta darajada polimorf marker va zarar o'rtasida rekombinasyonun chastotasini belgilanadi. Bilvosita diagnostik usullari, shuningdek, majburiy dastlabki bemorlar va mutatsiya tashuvchilar o'rtasida tahlil aholi o'rganish alal chastotalar qadam, plus manyetizm, muvozanatli bo'lmagan va hisobga marker va mutant allel rekombinasyonun ehtimolini aniqlash zarurligini beradi.

boshqa usullari

mikroskopik o'rganishga ostida ingl RNK yoki DNK qisqa segment, shuningdek bitta gen Shuning uchun, molekulyar genetik tashxis zarur Mutatsiyalar aniqlash, bo'lishi mumkin emas. "inson Genom loyihasi", shuningdek, molekulyar genetika boshqa yutuqlar bor, juda irsiy kasalliklarni tashxis ehtimoli kengaytirilgan - oldindan va postnatal ikkala. Bu usullar erta aniqlash va kimning debyut balog'atga bo'lib o'tadi bir bashorat poly- va monogenik kasalliklar, qilish mumkin. Afsuski, molekulyar genetik tadqiqotlar texnik imkoniyatlarini tufayli tashxis o'smirlik va bolalikdan, ayniqsa, ba'zan meros bilan bog'liq belgilangan axloqiy chegaralar bo'lmaslar.

Strukturaviy va raqamli kromozomal xato kasallik va saraton va ko'plab malformasyonların eng keng tarqalgan sabablar bor. Kromozomal burilish oila maslahat uchun muhim bo'lgan, aniqlanishi kerak - kelajak homiladorlik reproduktiv xavfi bilan birga, prognoz baholash uchun. Xromosoma tahlil genetik tashxis "oltin standart", lekin cheklangan. Faqat usullari molekulyar genetik tahlil mumtoz aniqlash mumkin emas nozik xromosomalari o'zgarishlar aniqlash, ularning yuqori sezgirlik qodir texnologiyasi asosidagi lyuminestsent belgilaridan klonlash bor ishlatiladi, chunki, yana, albatta, mumkin sitogenetik faoliyatlari. Bu metodlarni tobora bizning diagnostika imkoniyatlarini kengaytirib, o'rganib qachon, boshqa ko'plab irsiy kasalliklar bilan rivojlanish imkoniyati cheklangan, aqliy zaiflik, bolalar.

topilmalar

Bu gen tuzilishi va bilim funktsiya, o'zgaruvchanlik turlari, molekulyar genetika rivojlantirish munosabati bilan sodir bo'lgan irsiy kasalliklarni aniqlash uchun qobiliyati bor edi, insoniyat uchun juda muhim ahamiyatga ega. uning usullari DNK molekulasi o'rganish qaratilgan - va u qachon normal, va shikastlangan bo'lsa. nükleotid (DNK) deoksiribonükleik kislota-ketliklar tayyorlash individual parchalarini aniqlash namunalarni qabul bosqichlarida cho'zilgan. parchalar genomik hujayralari DNK, cheklash (yırtılma), ko'paytirish (Klon), elektroforez izolyatsiya (agaroz gel tomonidan ularning elektr zaryad va molekulyar og'irligi ajratish). Agar diskret sohilning yuzasida joylashgan maxsus parchalar aniqlash.

So'ngra, klonlanmış DNK fragmentlari yoki sintetik radioaktiv problardan har qism Hibridizasyonu o'tgan ish maxsus filtrlar, ichiga olish har bir sinov namunasi teng bo'ladi bir nazorat hisoblanadi. Agar prob bilan solishtirganda o'rnini va uzunligini o'zgartirish bo'lsa, agar yangi parcha yoki g'oyib - barcha bu tahlil gen nukleotid ketma-ketlikda qayta ro'y berdi, deb taklif qiladi. molekulyar genetik tadqiqotlar sakkiz asosiy metodlarni bor: ketma-ketliklar (DNK ketma-ketlikda aniqlash), polimeraz zanjir reaktsiyasi (ketliklar sonining oshishi), primerler ma'lum genlar tayyorlash, DNK klonlash, qayta birlashtiruvchi molekulalar tufayli qayta birlashtiruvchi molekulalar ishlab chiqarish olingan oqsillar, to'liq majmuini yaratish (yig'ish kutubxona) cheklovni yordamida olingan parchalar klonlandı.